BioHackerLab

Fra Bitraf
Revisjon per 17. jun. 2016 kl. 12:28 av Jarlemag (diskusjon | bidrag) (→‎Leverandører av utstyr og forbruksvarer)
Hopp til navigering Hopp til søk

BitLab? BioRaf?

Planlegging

Det har i det siste vært diskusjoner om å starte en egen lab for biologi på Bitraf. Bitraf har allerede medlemmer som jobber med hydroponics/aquaphonics og flere er interessert i ølbrygging. 18 Mai 2016 var det første møtet for folk som er interessert i å starte opp dette. Ønsket er å utvide foreningen med et lokale som egner seg for Gjør-det-selv-biologi og Biologi-hacking som retter seg etter norsk lov og de etiske retningslinjene fremsatt av European DIYbio Congress.

Summary from Bitraf's 1'st MeetUp: https://drive.google.com/file/d/0B5j_-m_-t56rMXNHVVkwVEpUVjg/view

Courses and Equipment: https://docs.google.com/spreadsheets/d/1M2TKaHVBQ3iLuV55A8JCwTCzPXx_aNDFoxyzZBgSM8o/edit#gid=0

Videre jobbing

De av deltakerne som ønsket å jobbe med dette videre delte seg i to grupper som skal jobbe med Mikrobiologi og Utstyr til labben. Mikrobiologi-gruppen har planer for å jobbe med ølbrygging og klassifisering av gjær med Open PCR.

Utstyr vi ønsker oss

  • OpenPCR
  • UV-kamera
  • Fumehood
  • Filter til Fumehood
  • Høypresisjons pipetter
  • Sentrifuge
  • Vortexer
  • Fryser
  • Elektroforese-kammer
  • Varmeskap med shaker
  • Mikroskop
  • Steam cooker for cleaning (Autoklav?)
  • Lab-glass (flasker, rør m.m.)
  • Filter-utstyr
  • Vekst-medier
  • Qubit Spectrometer (or similar)

I tillegg trenger vi også møblene til et slikt lokale. I Pløens Gate 4 finnes det ledige lokaler som man etter hvert kan etablere selve Lab'en i, men dette ligger et stykke fremover i tid. Finansiering må på plass før man kan ta over mere areal.

PCR prosjekt

Hva er PCR?

  • Polymerase chain reaction/polymerase kjedereaksjon: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
  • PCR brukes for å kopiere DNA. En PCR-maskin med reagenser er en "kopi-maskin" for DNA.
  • PCR kan brukes til å kopiere opp (amplifisere) DNA fra naturlige kilder/biologisk materiale for videre bearbeidelse eller analyse.
  • DNA-fragmenter med en kjent sekvens (rekkefølge på nukleotider, "bokstavene" i DNA) i hver ende velges ut og kopieres selektivt.
  • Sammensetning og lengde av DNA-tråden mellom start- og sluttpunktet kan variere. Informajson om lengden av DNA-fragmentene (visualiseres ved gel-elektroforese), og om kopiering fant sted (positiv/negativ reaksjon) kan brukes til å gjøre enkle genetiske analyser.
  • Opparbeidet DNA kan (gitt god nok mengde og kvalitet) sendes til nærmere analyse av DNA-sekvensen (sekvensering).

Hvorfor gjøre PCR?

  • En aktivitet med relativt lav terskel, med begrenset behov for opplæring, gode muligheter for å lykkes, overkommelige kostnader og få risikomomenter.
  • En klassisk molekylærbiologi-teknikk. I daglig bruk verden over. Uunnværlig for molekylærbiologisk forskning og medisinsk diagnostikk. Nobelpris-vinnende.
  • Potensiale for praktiske anvendelser med allmenn interesse. F.eks kontroll av artsopprinnelse for matvarer.

Hva trengs for PCR?

Fast utstyr:

  • PCR-maskin/thermocycler. Automatiserer temperaturegulering gjennom reaksjonsforløpet. Temperatur-regulering kan i teorien gjøres manuelt med vannbad ved ulike temperaturer, men dette blir temmelig langsomt og kjedelig
  • Mikropipette(r). Fortrinnsvis minst én automatpipette med justerbart volum i området 1-10 μL.
  • En eller flere flasker til agarose, ca. 250 mL. Glass eller varmebestandig plast, bør passe i mikrobølgeovn.
  • Mikrobølgeovn til oppvarming av agarose, evt. annen varmekilde + magnetrører
  • Gel-elektroforesekammer
  • Strømforsyning
  • Transilluminator m/filter og/eller filterbriller
  • Bør ha: Mikrosentrifuge.
  • Bør ha: Kjøleskap/fryser til oppbevaring av reagenser (PCR mastermix bør oppbevares frosset) og lage is
  • Kjekt å ha: Vanndestillator
  • Kjekt å ha: Liten isoporboks eller lignende til å ha is i, for kjøling av prøver under forberedelse.

Forbruksmaterialer:

  • Eppendorf-rør (plastrør tilpasset mikrosentrifuge, ca. 1.5 mL)
  • PCR-rør (plastrør tilpasset PCR-maskin, ca 0.5 mL)
  • Pipette-spisser til automatpipette(r)

Reagenser/kjemikalier:

  • PCR mastermix
  • TAE/TBE buffer, konsentrert
  • DNA-fargestoff (Riktig type med hensyn til transilluminator)
  • DNA-ladder (Blanding av DNA-fragmenter med kjent lengde. Brukes som referanse for lengde/størrelse av DNA-fragmenter ved elektroforese.)
  • DNA loading dye (Viskøs fargeblanding til utblanding av PCR-produkt før overføring til agarosegel. Kan "hjemmesnekres"?)
  • Elektroforese-agarose
  • DNA-primere (eksperiment-spesifikke)
  • Vann, fortrinnsvis destillert. Evt. flaskevann med lavt mineralinnhold.

Sikkerhetsutstyr:

  • Vernebriller
  • Engangshansker
  • Varmeisolerende hansker e.l. til håndtering av varm agarose
  • Fortrinnsvis labfrakk

Sikkerhetsmomenter:

  • Strøm gjennom elektroforesekammer (ca. 50-100 V)
  • Varm agaroseløsning
  • Støtkoking eller glasseksplosjon ved oppvarming av agarose i mikrobølgeovn. Unngås ved å begrense effekt/oppvarmingshastighet, begrense tid under oppvarming og aldri varme opp lukkede flasker/beholdere.
  • Potensielt skadelige kjemikalier (eks. Ethidum-bromid, "ETBR") og fargestoff som krever bruk av transilluminator med UV-stråling bør unngås. Alternativer med lavere risiko og bedre miljøprofil bør brukes, f.eks "GelGreen" fargestoff (brukes med transilluminator med synlig blått lys, redusert fare for øye/hudskader).

Avfallshåndtering:

Avhenger av reagensvalg! Individuell vurdering må gjøres for hvert stoff. Generelt:

  • Størknet agarose kastes som restavfall. Flytende agarose må ikke tømmes i avløp, da dette vil størkne ved avkjøling.
  • Øvrige flytende reagenser kan helles i avløp
  • Forbruksmateriell av plast med eventuelle reagensrester kastes i restavfall
  • Utstyr rengjøres med vann etter bruk

Reagenser, mulige leverandører og prisoverslag:

PCR-reagenser:

DongSheng Biotech: http://dongshengbio.com/en/cpjs.asp?classname=PCR%20Products

Taq Mix: http://dongshengbio.com/en/xxcp.asp?id=330/ http://dongshengbio.com/en/UploadFiles/2012516105050871.pdf

Eksempel-bestilling (2014):

Product Name Cat No Description Qty Unit Unit Price Value

Taq Mix (2x) P2011 1 1ml $8.80 $8.80

Water, nuclease-free P9021 1 5x1ml $2.00 $2.00

PCR and DNA Fragment Purification Kit N1091 1 50preps $20.00 $20.00

50bp ladder M1041 1 50ug $16.00 $16.00

6xDNA Loading Dye M9041 1 5x1ml $4.60 $4.60

shipment viaFedEx $55.00

Total $106.40

DNA-fargestoff:

GelGreen:

https://biotium.com/technology/gelred-gelgreen-nucleic-acid-gel-stains/

GelGreen, Carolina.com: http://www.carolina.com/biotechnology-electrophoresis-reagents/gel-green/217305.pr?question= (ca. $64.50 + shipping / 150 uL 10 000 x konsentrasjon. Nok til ca. 30-40 agarose-geleer.)

Suggested protocols for working with GelGreen: http://embitec.com/downloads/Suggested_Protocols-GelGreen.pdf

GelRed-GelGreen Safety report: http://biotium.com/wp-content/uploads/2013/07/GR-GG-Safety.pdf

Elektroforese-buffer:

TAE (Tris/Acetate/EDTA)-buffer, Promega: https://no.promega.com/products/biochemicals-and-labware/biochemical-buffers-and-reagents/tae-buffer_-molecular-biology-grade-_tris_acetate_edta_/ (390 kr/1000 mL 10x konsentrasjon = 39 kr/L ferdig buffer)

TAE elektroforesebuffer 50 x, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/tae-elektroforesebuffer-50x (1 250 kr/ 500 mL 50x konsentrasjon = 50 kr/L ferdig buffer

TBE (Tris/Borate/EDTA)-buffer kan også brukes.

Elektroforese-agarose:

Agarose, 10 g, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/agarose--10-g (kr 319 + frakt. Nok til ca. 10 agarose-gel'er (Gitt 50 mL 2 % agarose). Temmelig dyrt...Har tidligere kjøpt 100g på eBay for USD 40 + frakt.

DNA-primere: Macrogen Inc:

Ca. 0.2 EUR/basepar (bp) x ca. 30 bp x 2 primere = ca. 12 EUR Shipping ca 20 Sum ca. 30-40 EUR. (2013-priser)

Artikler/protokoller og lesestoff


DNA Learning Center Biology Animation Library - Polymerase Chain Reaction: https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Possible sub-projects/experiments

In rough order of increasing difficulty/complexity?

  • Electrophoresis demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for agarose gel electrophoresis. Separate and visualize DNA fragments of known size (DNA ladder).
  • PCR demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for PCR and agarose gel electrophoresis. Amplify DNA fragment of known expected size from purified DNA or from biological material (yeast?). Visualize and determine size/length of the DNA fragment(s) by agarose gel electrophoresis.
  • Animal tissue/foodstuff species identification: Demonstrate/test identification of DNA from a suspected/known species in raw or processed food (ex, horsemeat).


DIY PCR-maskiner - Eksisterende design og prosjekter

http://openpcr.org/

https://www.kickstarter.com/projects/563115656/3d-printer-into-pcr-machine-conversion

Arduino PCR thermal cycler for under $85: http://www.instructables.com/id/Arduino-PCR-thermal-cycler-for-under-85/?ALLSTEPS

"Coffee Cup PCR": http://www.instructables.com/id/Coffee-Cup-PCR-Thermocycler-costing-under-350/?ALLSTEPS

http://www.popsci.com/diy/article/2013-04/gene-machine

Tilgjengelige primere

Navn Sekvens Beskrivelse Lengde Templat
Ec_lld_Rev GTTTCTTCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAtgcaggtctcctggagtccacgc REV-primer for E. coli lld promoter + RBS. Se http://2012.igem.org/Team:NTNU_Trondheim/Experiments_and_Results 52 E. coli
Ec_lld_FWD GTTTCTTCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGcacattcctataggccgagtaaggt FWD-primer for E. coli lld promoter + RBS. 55 E. coli
Fd2trim GAGTTTGATCATGGCTCAG Wide-range bacterial.
Porcine FWD + Porcine REV [2]

MEATF + MEATR [2]

HorseSSR-FWD + HorseSSR-REV [2]

S-D-Bact-0515-a-A-19 + S-D-Bact-0341-b-S-17 [1]

[1]: See http://openwetware.org/wiki/User:Jarle_Pahr/16S_RNA

[2]: See http://openwetware.org/wiki/User:Jarle_Pahr/Meat

Primers of interest / Shopping list

Yeasts:

"V9D (5'-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3') and LS266 (5'-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3') are used to amplify an 800-1300 bp fragment that encompasses a portion of the 18S and 28S rRNA genes and the entire intervening ITS1, 5.8S and ITS2 rRNA regions." (Todd M Pryce. "Detection and Identification of Fungi by PCR and DNA sequencing" in PCR for Clinical Microbiology, SpringerLink 2010.)

ITS 1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') + ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'). " In the present study, the restriction patterns generated from the region spanning the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and the 5.8S rRNA gene were used to identify a total of 132 yeast species belonging to 25 different genera, including teleomorphic and anamorphic ascomycetous and basidiomycetous yeasts." (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10028278, full text available through ResearchGate).


E. coli:

rrnB p1_74bp_FWD_R caaccggtgttgcgcggtcagaaaatta rrnB p1_74bp_REV_R gtacatgtagtggtggcgcattatagg

Gives a short fragment.

pSB-M1g/pJP-1 plasmids:

pSB-SeqA/GFP-END-LVA-REV. Sequencing of and/or PCR demonstration using plasmid pSB-M1g. PCR from pSB-M1g without adding LVA tag should give fragment of aprox. 800 bp (size of GFP ORF + ~ 1 bp upstream).

pSB-SeqA: tgcaagaagcggatacag

GFP-END-LVA-REV: agaggatcccttaagttaagctactaaagcgtagttttcgtcgtttgctgctttgtatagttcatccatgcc (LVA sequence can be removed from the 5' end).

For PCR from pJP-1, replace pSB-seqA with pJP-1_seq5 (binding site is upstream of AgeI, as such this site is preserved from pSB-mg1, and this primer combination can also be used with pSB-mg1 for a longer PCR fragment)

Lenker

Andre grupper og nettsteder

BioHack Academy: https://biohackacademy.github.io/

https://diybio.org/

GenSpace: http://genspace.org/

http://biocurious.org/

http://biologigaragen.org/

https://biohackspace.org/

http://www.diybiogroningen.org/

http://www.indiebiotech.com/

Liste over grupper på DIYbio.org: https://diybio.org/local/

BioHacklabs.org Wiki: http://www.biohacklabs.org/Main_Page

HMS

WHO Laboratory Biosafety Manual, Third Edition: http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf

NTNU - Arbeid med biologiske faktorer: https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Arbeid+med+biologiske+faktorer

https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Biologiske+faktorer

Lover og forskrifter

Lover og forskrifter som er lenket til vil ikke nødvendigvis gjelde for aktiviteter ved Bitraf, men kan likevel brukes som en kilde til HMS-relevant informasjon og veiledning:

Forskrift om utforming og innretning av arbeidsplasser og arbeidslokaler (arbeidsplassforskriften) - Kapittel 8. Arbeid i omgivelser som kan medføre eksponering for biologiske faktorer: http://lovdata.no/forskrift/2011-12-06-1356/§8-1


Forskrift om tiltaksverdier og grenseverdier for fysiske og kjemiske faktorer i arbeidsmiljøet samt smitterisikogrupper for biologiske faktorer (forskrift om tiltaks- og grenseverdier) : https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1358

Forskrift om utførelse av arbeid, bruk av arbeidsutstyr og tilhørende tekniske krav (forskrift om utførelse av arbeid) -Andre del: Krav til arbeid med kjemiske og biologiske risikofaktorer: https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1357/KAPITTEL_2#KAPITTEL_2

Litteratur

Bøker

Biohackers: The Politics of Open Science: http://www.amazon.com/Biohackers-Politics-Science-Alessandro-Delfanti/dp/0745332803/ref=sr_1_3?s=books&ie=UTF8&qid=1463928520&sr=1-3&keywords=biohacker

Open-Source Lab: How to Build Your Own Hardware and Reduce Research Costs: http://www.amazon.com/dp/0124104622/ref=wl_it_dp_o_pC_S_ttl?_encoding=UTF8&colid=2JXTKSS1LI8NT&coliid=I2AIVHRBOC69DXhttp://www.amazon.com/dp/0124104622/ref=wl_it_dp_o_pC_S_ttl?_encoding=UTF8&colid=2JXTKSS1LI8NT&coliid=I2AIVHRBOC69DX

Biopunk: Solving Biotech's Biggest Problems in Kitchens and Garages: http://www.amazon.com/Biopunk-Solving-Biotechs-Problems-Kitchens/dp/1617230073/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1463930140&sr=1-1&keywords=biopunk

The Machinery of Life: http://www.amazon.com/Machinery-Life-David-S-Goodsell/dp/0387849246/ref=pd_sim_14_5?ie=UTF8&dpID=51ZSNcQ3vrL&dpSrc=sims&preST=_AC_UL160_SR106%2C160_&refRID=156THN5QQ1RD2Q4DQ5XB

Illustrated Guide to Home Biology Experiments: http://www.amazon.com/Illustrated-Guide-Home-Biology-Experiments/dp/1449396593?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o08_s00

Techniques in microbiology - a student handbook: http://www.amazon.com/Techniques-Microbiology-Handbook-John-Lammert/dp/0132240114?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o04_s00

Biology Is Technology: The Promise, Peril, and New Business of Engineering Life: http://www.amazon.com/dp/0674060156/ref=rdr_ext_tmb

Exploring Personal Genomics: http://www.amazon.com/Exploring-Personal-Genomics-Joel-Dudley/dp/0199644497?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o06_s00


The Art of Fermentation: An In-Depth Exploration of Essential Concepts and Processes from around the World: http://www.amazon.com/Art-Fermentation-Depth-Exploration-Essential/dp/160358286X?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o06_s00

Artikler

DIY Bio:

European do-it-yourself (DIY) biology: Beyond the hope, hype and horror: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4158858/


DNA barcoding:

Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)region as a universal DNA barcode marker for 

Fungi: https://www.academia.edu/12648759/Nuclear_ribosomal_internal_transcribed_spacer_ITS_region_as_a_universal_DNA_barcode_marker_for_Fungi?auto=view&campaign=weekly_digest

Kommersielt tilgjengelig utstyr

PCR

"MiniPCR" (Samme pris som ferdigbygd OpenPCR, $650. Ikke DIY): http://www.minipcr.com/product-category/equipment-and-accessories/minipcr-thermal-cycler/

OpenPCR: http://openpcr.org/

Elektroforese og transilluminasjon

DarkReader Blue Light Transilluminator: http://www.clarechemical.com/transilluminator.htm

Kommersielt tilgjengelige reagenser og forbruksvarer

PCR

http://www.minipcr.com/product-category/minipcr-learning-labs-and-kits/

Elektroforese og transilluminasjon

https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/

Leverandører av utstyr og forbruksvarer

Forbruksvarer og reagenser:

http://www.the-odin.com/

http://www.geneandcell.com/

http://dongshengbio.com/en/index.asp

Oligomer-syntese og sekvensering:

http://macrogen.com/eng/

http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/standard-dna-synthesis.html

Hentet fra «https://wiki.bitraf.no/w/index.php?title=BioHackerLab&oldid=1645»