BitLab? BioRaf?

Innhold

1 Planlegging
2 Videre jobbing
- 2.1 Utstyr vi ønsker oss
- 2.2 PCR prosjekt
3 Lenker

Planlegging

Det har i det siste vært diskusjoner om å starte en egen lab for biologi på Bitraf. Bitraf har allerede medlemmer som jobber med hydroponics/aquaphonics og flere er interessert i ølbrygging. 18 Mai 2016 var det første møtet for folk som er interessert i å starte opp dette. Ønsket er å utvide foreningen med et lokale som egner seg for Gjør-det-selv-biologi og Biologi-hacking som retter seg etter norsk lov og de etiske retningslinjene fremsatt av European DIYbio Congress.

Summary from Bitraf's 1'st MeetUp: https://drive.google.com/file/d/0B5j_-m_-t56rMXNHVVkwVEpUVjg/view

Courses and Equipment: https://docs.google.com/spreadsheets/d/1M2TKaHVBQ3iLuV55A8JCwTCzPXx_aNDFoxyzZBgSM8o/edit#gid=0

Videre jobbing

De av deltakerne som ønsket å jobbe med dette videre delte seg i to grupper som skal jobbe med Mikrobiologi og Utstyr til labben. Mikrobiologi-gruppen har planer for å jobbe med ølbrygging og klassifisering av gjær med Open PCR.

Utstyr vi ønsker oss

OpenPCR
UV-kamera
Fumehood
Filter til Fumehood
Høypresisjons pipetter
Sentrifuge
Vortexer
Fryser
Elektroforese-kammer
Varmeskap med shaker
Mikroskop
Steam cooker for cleaning (Autoklav?)
Lab-glass (flasker, rør m.m.)
Filter-utstyr
Vekst-medier
Qubit Spectrometer (or similar)

I tillegg trenger vi også møblene til et slikt lokale. I Pløens Gate 4 finnes det ledige lokaler som man etter hvert kan etablere selve Lab'en i, men dette ligger et stykke fremover i tid. Finansiering må på plass før man kan ta over mere areal.

PCR prosjekt

Hva er PCR?

Polymerase chain reaction/polymerase kjedereaksjon: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
PCR brukes for å kopiere DNA. En PCR-maskin med reagenser er en "kopi-maskin" for DNA.
PCR kan brukes til å kopiere opp (amplifisere) DNA fra naturlige kilder/biologisk materiale for videre bearbeidelse eller analyse.
DNA-fragmenter med en kjent sekvens (rekkefølge på nukleotider, "bokstavene" i DNA) i hver ende velges ut og kopieres selektivt.
Sammensetning og lengde av DNA-tråden mellom start- og sluttpunktet kan variere. Informajson om lengden av DNA-fragmentene (visualiseres ved gel-elektroforese), og om kopiering fant sted (positiv/negativ reaksjon) kan brukes til å gjøre enkle genetiske analyser.
Opparbeidet DNA kan (gitt god nok mengde og kvalitet) sendes til nærmere analyse av DNA-sekvensen (sekvensering).

Hvorfor gjøre PCR?

En aktivitet med relativt lav terskel, med begrenset behov for opplæring, gode muligheter for å lykkes, overkommelige kostnader og få risikomomenter.
En klassisk molekylærbiologi-teknikk. I daglig bruk verden over. Uunnværlig for molekylærbiologisk forskning og medisinsk diagnostikk. Nobelpris-vinnende.
Potensiale for praktiske anvendelser med allmenn interesse. F.eks kontroll av artsopprinnelse for matvarer.

Hva trengs for PCR?

Fast utstyr:

PCR-maskin/thermocycler. Automatiserer temperaturegulering gjennom reaksjonsforløpet. Temperatur-regulering kan i teorien gjøres manuelt med vannbad ved ulike temperaturer, men dette blir temmelig langsomt og kjedelig
Mikropipette(r). Fortrinnsvis minst én automatpipette med justerbart volum i området 1-10 μL.
En eller flere flasker til agarose, ca. 250 mL. Glass eller varmebestandig plast, bør passe i mikrobølgeovn.
Mikrobølgeovn til oppvarming av agarose, evt. annen varmekilde + magnetrører
Gel-elektroforesekammer
Strømforsyning
Transilluminator m/filter og/eller filterbriller
Bør ha: Mikrosentrifuge.
Bør ha: Kjøleskap/fryser til oppbevaring av reagenser (PCR mastermix bør oppbevares frosset) og lage is
Kjekt å ha: Vanndestillator
Kjekt å ha: Liten isoporboks eller lignende til å ha is i, for kjøling av prøver under forberedelse.

Forbruksmaterialer:

Eppendorf-rør (plastrør tilpasset mikrosentrifuge, ca. 1.5 mL)
PCR-rør (plastrør tilpasset PCR-maskin, ca 0.5 mL)
Pipette-spisser til automatpipette(r)

Reagenser/kjemikalier:

PCR mastermix
TAE/TBE buffer, konsentrert
DNA-fargestoff (Riktig type med hensyn til transilluminator)
DNA-ladder (Blanding av DNA-fragmenter med kjent lengde. Brukes som referanse for lengde/størrelse av DNA-fragmenter ved elektroforese.)
DNA loading dye (Viskøs fargeblanding til utblanding av PCR-produkt før overføring til agarosegel. Kan "hjemmesnekres"?)
Elektroforese-agarose
DNA-primere (eksperiment-spesifikke)
Vann, fortrinnsvis destillert. Evt. flaskevann med lavt mineralinnhold.

Sikkerhetsutstyr:

Vernebriller
Engangshansker
Varmeisolerende hansker e.l. til håndtering av varm agarose
Fortrinnsvis labfrakk

Sikkerhetsmomenter:

Strøm gjennom elektroforesekammer (ca. 50-100 V)
Varm agaroseløsning
Støtkoking eller glasseksplosjon ved oppvarming av agarose i mikrobølgeovn. Unngås ved å begrense effekt/oppvarmingshastighet, begrense tid under oppvarming og aldri varme opp lukkede flasker/beholdere.
Potensielt skadelige kjemikalier (eks. Ethidum-bromid, "ETBR") og fargestoff som krever bruk av transilluminator med UV-stråling bør unngås. Alternativer med lavere risiko og bedre miljøprofil bør brukes, f.eks "GelGreen" fargestoff (brukes med transilluminator med synlig blått lys, redusert fare for øye/hudskader).

Avfallshåndtering:

Avhenger av reagensvalg! Individuell vurdering må gjøres for hvert stoff. Generelt:

Størknet agarose kastes som restavfall. Flytende agarose må ikke tømmes i avløp, da dette vil størkne ved avkjøling.
Øvrige flytende reagenser kan helles i avløp
Forbruksmateriell av plast med eventuelle reagensrester kastes i restavfall
Utstyr rengjøres med vann etter bruk

Reagenser, mulige leverandører og prisoverslag:

PCR-reagenser:

DongSheng Biotech: http://dongshengbio.com/en/cpjs.asp?classname=PCR%20Products

Taq Mix: http://dongshengbio.com/en/xxcp.asp?id=330/ http://dongshengbio.com/en/UploadFiles/2012516105050871.pdf

Eksempel-bestilling (2014):

Product Name Cat No Description Qty Unit Unit Price Value

Taq Mix (2x) P2011 1 1ml $8.80 $8.80

Water, nuclease-free P9021 1 5x1ml $2.00 $2.00

PCR and DNA Fragment Purification Kit N1091 1 50preps $20.00 $20.00

50bp ladder M1041 1 50ug $16.00 $16.00

6xDNA Loading Dye M9041 1 5x1ml $4.60 $4.60

shipment viaFedEx $55.00

Total $106.40

DNA-fargestoff:

GelGreen:

https://biotium.com/technology/gelred-gelgreen-nucleic-acid-gel-stains/

GelGreen, Carolina.com: http://www.carolina.com/biotechnology-electrophoresis-reagents/gel-green/217305.pr?question= (ca. $64.50 + shipping / 150 uL 10 000 x konsentrasjon. Nok til ca. 30-40 agarose-geleer.)

Suggested protocols for working with GelGreen: http://embitec.com/downloads/Suggested_Protocols-GelGreen.pdf

GelRed-GelGreen Safety report: http://biotium.com/wp-content/uploads/2013/07/GR-GG-Safety.pdf

Elektroforese-buffer:

TAE (Tris/Acetate/EDTA)-buffer, Promega: https://no.promega.com/products/biochemicals-and-labware/biochemical-buffers-and-reagents/tae-buffer_-molecular-biology-grade-_tris_acetate_edta_/ (390 kr/1000 mL 10x konsentrasjon = 39 kr/L ferdig buffer)

TAE elektroforesebuffer 50 x, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/tae-elektroforesebuffer-50x (1 250 kr/ 500 mL 50x konsentrasjon = 50 kr/L ferdig buffer

TBE (Tris/Borate/EDTA)-buffer kan også brukes.

Elektroforese-agarose:

Agarose, 10 g, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/agarose--10-g (kr 319 + frakt. Nok til ca. 10 agarose-gel'er (Gitt 50 mL 2 % agarose). Temmelig dyrt...Har tidligere kjøpt 100g på eBay for USD 40 + frakt.

DNA-primere: Macrogen Inc:

Ca. 0.2 EUR/basepar (bp) x ca. 30 bp x 2 primere = ca. 12 EUR Shipping ca 20 Sum ca. 30-40 EUR. (2013-priser)

Artikler/protokoller og lesestoff

The PCR controls you must use: http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/
Yaest colony PCR. Utvalg av protokoller @ OpenWetware: http://openwetware.org/wiki/Yeast_Colony_PCR
http://www.jove.com/video/3998/polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
Simple And Reliable Procedure For PCR Amplification Of Genomic Dna From Yeast Cells Using Short Sequencing Primers: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
http://openwetware.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
http://no.frederiksen.eu/inspirasjon/biologi/bioteknologi/tips-og-raad
http://www.naturfag.no/utstyrsbeskrivelse/vis.html?tid=709639

DNA Learning Center Biology Animation Library - Polymerase Chain Reaction: https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Possible sub-projects/experiments

In rough order of increasing difficulty/complexity?

Electrophoresis demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for agarose gel electrophoresis. Separate and visualize DNA fragments of known size (DNA ladder).
PCR demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for PCR and agarose gel electrophoresis. Amplify DNA fragment of known expected size from purified DNA or from biological material (yeast?). Visualize and determine size/length of the DNA fragment(s) by agarose gel electrophoresis.
Animal tissue/foodstuff species identification: Demonstrate/test identification of DNA from a suspected/known species in raw or processed food (ex, horsemeat).

DIY PCR-maskiner - Eksisterende design og prosjekter

http://openpcr.org/

https://www.kickstarter.com/projects/563115656/3d-printer-into-pcr-machine-conversion

Arduino PCR thermal cycler for under $85: http://www.instructables.com/id/Arduino-PCR-thermal-cycler-for-under-85/?ALLSTEPS

"Coffee Cup PCR": http://www.instructables.com/id/Coffee-Cup-PCR-Thermocycler-costing-under-350/?ALLSTEPS

Lenker

Andre grupper og nettsteder

BioHack Academy: https://biohackacademy.github.io/

https://diybio.org/

HMS

WHO Laboratory Biosafety Manual, Third Edition: http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf

NTNU - Arbeid med biologiske faktorer: https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Arbeid+med+biologiske+faktorer

https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Biologiske+faktorer

Lover og forskrifter

Lover og forskrifter som er lenket til vil ikke nødvendigvis gjelde for aktiviteter ved Bitraf, men kan likevel brukes som en kilde til HMS-relevant informasjon og veiledning:

Forskrift om utforming og innretning av arbeidsplasser og arbeidslokaler (arbeidsplassforskriften) - Kapittel 8. Arbeid i omgivelser som kan medføre eksponering for biologiske faktorer: http://lovdata.no/forskrift/2011-12-06-1356/§8-1

Forskrift om tiltaksverdier og grenseverdier for fysiske og kjemiske faktorer i arbeidsmiljøet samt smitterisikogrupper for biologiske faktorer (forskrift om tiltaks- og grenseverdier) : https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1358

Forskrift om utførelse av arbeid, bruk av arbeidsutstyr og tilhørende tekniske krav (forskrift om utførelse av arbeid) -Andre del: Krav til arbeid med kjemiske og biologiske risikofaktorer: https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1357/KAPITTEL_2#KAPITTEL_2