BioHackerLab/Protokoller
Innhold
Resuspendering av DNA-primere
Ta røret med tørket DNA ut av pakken. Kontroller at ID og DNA-sekvens oppgitt på røret stemmer med bestillingen.
Plasser røret i en mikrosentrifuge og sentrifuger i ca. 30 sekunder.
Tilsett NF-vann til konsentrasjon etter oppløsning lik 100 pmol/uL (0.1 mM, 100 uM). Se siden av røret eller medfølgende dokumentasjon fra leverandør for total mengde DNA i røret og/eller mengde vann som må tilsettes for endelig konsentrasjon ~100 pmol/uL
Bland ved å knipse på og riste flasken, eller med en vortex-mikser. Sentrifuger til slutt røret igjen.
Oppbevar fryst, fortrinnsvis ved -20C.
Før bruk til PCR vil det være hensiktsmessig å foreta ytterligere 10X fortynning til 10 pmol/uL (10 uM) i et eget rør, som også kan oppbevares fryst og brukes flere ganger. Dette reduserer også behovet for å åpne hovedrøret og reduserer risikoen for kontaminasjon av dette.
Elektroforese
OBS: Les gjennom hele protokollen før gjennomførelse for å bli kjent med relevant sikkerhetsinformasjon.
Støping av agarose-gel:
Om nødvendig, lag TAE buffer i brukskonsentrasjon ved å fortynne konsentrert buffer i destillert vann. For å lage 1x TAE buffer fra 10x TAE buffer, bland 1 del TAE buffer og 9 deler destillert vann. TAE buffer er irriterende. Bruk hansker ved håndtering av konsentrert buffer.
Tilsett gradvis ~1 v/v % agarose til 1x TAE buffer (~1g til 100 mL, f.eks 0.5g for 50 mL) i en flaske med volum minst to ganger volumet av løsningen, fortrinnsvis under omrøring med magnetrører - eventuelt rør for hånd med glasstav eller ved å bevege flasken.
OBS: Flasken må ikke være lufttett!
Varm løsningen i mikrobølgeovn på høy styrke til løsningen koker (ca. ett minutt). La løsningen koke i ca. 30 sekunder. Reduser varmeeffekten eller skru av ovnen dersom løsningen koker over.
Fjern flasken fra mikrobølgeovnen. Bland løsningen ved å bevege flasken forsiktig i en roterende bevegelse for hånd, eller med en magnetrører. Utvis forsiktighet for å unngå sprut. Kontroller at agarose-løsningen er klar og uten synlige partikler. Dersom det er partikler og uløst agarose i løsningen, kok løsningen igjen.
OBS: Bruk øyebeskyttelse! Fare for støtkoking og sprut også etter at oppvarmingen har opphørt. Flasken er varm. Bruk varmebeskyttende hansker eller annen håndbeskyttelse ved håndtering av flaske. Bruk fortrinnsvis labfrakk eller langarmede klær og unngå eksponering av bar hud. Fare for forbrenning ved søl eller sprut.
Tilsett DNA-fargestoff i henhold til konsentrasjonsangivelse. F.eks, for 10 000x konsentrert fargestoff, tilsett 1 uL fargestoff per 10 mL agarose løsning (5 uL for 50 mL).
Plasser et gel-støpekar på tvers av lengderetningen i et elektroforesekar og plasser en brønnkam i støpekaret. Hell varm agaroseløsning i kammeret og la stå til gel'en er størknet (ca. 30-60 minutter).
OBS: Elektroforesekaret skal være frakoblet fra strømforsyning når gel'en støpes.
Ta ut brønnkammen og snu støpekaret slik at prøvebrønnene er nærmest den sorte (postive) elektroden.
Hell 1x TAE buffer i elektroforesekaret slik at gel'en er dekket av buffer.
Tilsett prøvene i prøvebrønnene.
Sett på lokket på elektroforesekaret.
Koble ledningene til strømforsyningen. Utvis forsiktighet og bruk fortrinnsvis kun en hånd for å redusere risiko for strøm gjennom kroppen.
OBS: Strømforsyningen skal være avslått når ledningene kobles til.
Skru på strømforsyningen.
Juster til ønsket spenning og skru på spenningen.
La elektroforesen foregå uforstyrret. Ikke rør kammeret eller ledningene så lenge spenningen er på.
Skru av spenningen på strømforsyningen.
Skru av strømforsyningen.
Koble ledningene fra strømforsyningen. Utvis forsiktighet og bruk fortrinnsvis kun en hånd for å redusere risiko for strøm gjennom kroppen.
Ta av lokket på elektroforesekaret.
FLytt agarosegeleen forsiktig til en transilluminator ved hjelp av en stekespade e.l.
Avhend agarose-gel, bufferløsning og forbruksmateriell på forsvarlig vis etter bruk. Skyll elektroforesekammer og glassutstyr med destillert vann.
Se også: https://www.addgene.org/plasmid-protocols/gel-electrophoresis/
http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html
Typisk prøvevolum kan være 6 uL, f.eks 5 uL PCR-produkt + 1 uL 6x loading dye, eller 4 uL vann, 1 uL DNA ladder og 1 uL 6x loading dye.
PCR
Typiske reaksjonsvolum er 20 uL og 50 uL. Gitt en konsentrasjon i primerløsningen lik 10 uM vil i de to tilfellene tilsetting av henholdsvis 1 uL og 2.5 uL av hver primer gi en endelig kosentrasjon av hver primer lik 0.5 uM i reaksjonsblandingen.
http://dongshengbio.com/en/UploadFiles/2012516105050871.pdf
https://www.neb.com/protocols/1/01/01/pcr-protocol-m0530
Typisk vil en ta ut ca. 5 uL av reaksjonsblandingen til elektroforese-analyse etter PCR.
Koloni-PCR
1. From an agar plate, select one or several colonies for colony PCR. For each colony selected, pick a small amount of colony material using a sterile pipette tip, and dissolve in 50 uL H2O. Reseed a new agar plate with 5 uL of the resulting solution(s) each in a separate spot, keeping the spots separate and noting the location of each. Alternatively, use 5 uL to inoculate a liquid culture.
Incubate the dissolved colony material at 96 C for 10 min to release DNA.
Use 1 uL of the heat-treated solution as template for PCR.
Lagring av bakterie-stammer i glycerol
- 1 Prepare a solution of 60 % v/v glycerol in water. (For 25 mL, mix 10 mL water and 15 mL glycerol)
- 2 Add 400 uL 60 % glycerol solution and 800 uL of the culture to be stored in a cryogenic tube.
- 3 Mix thoroughly!
- 4 Place in 5 C refrigerator for 30 min, then move to -80 C freezer.
