BitLab? BioRaf?

Innhold

1 Planlegging
2 Videre jobbing
- 2.1 Utstyr vi ønsker oss
- 2.2 PCR prosjekt
3 Lenker

Planlegging

Det har i det siste vært diskusjoner om å starte en egen lab for biologi på Bitraf. Bitraf har allerede medlemmer som jobber med hydroponics/aquaphonics og flere er interessert i ølbrygging. 18 Mai 2016 var det første møtet for folk som er interessert i å starte opp dette. Ønsket er å utvide foreningen med et lokale som egner seg for Gjør-det-selv-biologi og Biologi-hacking som retter seg etter norsk lov og de etiske retningslinjene fremsatt av European DIYbio Congress.

Summary from Bitraf's 1'st MeetUp: https://drive.google.com/file/d/0B5j_-m_-t56rMXNHVVkwVEpUVjg/view

Courses and Equipment: https://docs.google.com/spreadsheets/d/1M2TKaHVBQ3iLuV55A8JCwTCzPXx_aNDFoxyzZBgSM8o/edit#gid=0

Videre jobbing

De av deltakerne som ønsket å jobbe med dette videre delte seg i to grupper som skal jobbe med Mikrobiologi og Utstyr til labben. Mikrobiologi-gruppen har planer for å jobbe med ølbrygging og klassifisering av gjær med Open PCR.

Utstyr vi ønsker oss

OpenPCR: Har 1x.
UV-kamera: Kan ved bruk av GelGreen og tilsvarende DNA-fargestoffer erstattes med transilluminator med synlig (blått) lys. Har 1x Dark Reader blue light transilluminator
Fumehood
Filter til Fumehood
Høypresisjons pipetter: Har automatpipetter for områdene 1-10, 10-100 og 100-1000 uL.
Sentrifuge: Har 1x mikrosentrifuge for 1.5 mL-rør.
Vortexer: Har 1x (uprøvd).
Fryser (ideelt -20 C)
Kjøleskap
Elektroforese-kammer: Har 2x
Varmeskap med shaker
Mikroskop: Har 1x Bresser Erudite DLX.
Steam cooker for cleaning (Autoklav?): Har 1x uprøvd autoklav (kjøpt brukt, har løs bunn. Kan det repareres/sveises?)
Lab-glass (flasker, rør m.m.)
Filter-utstyr
Vekst-medier
Qubit Spectrometer (or similar)

I tillegg trenger vi også møblene til et slikt lokale. I Pløens Gate 4 finnes det ledige lokaler som man etter hvert kan etablere selve Lab'en i, men dette ligger et stykke fremover i tid. Finansiering må på plass før man kan ta over mere areal.

PCR prosjekt

Hva er PCR?

Polymerase chain reaction/polymerase kjedereaksjon: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
PCR brukes for å kopiere DNA. En PCR-maskin med reagenser er en "kopi-maskin" for DNA.
PCR kan brukes til å kopiere opp (amplifisere) DNA fra naturlige kilder/biologisk materiale for videre bearbeidelse eller analyse.
DNA-fragmenter med en kjent sekvens (rekkefølge på nukleotider, "bokstavene" i DNA) i hver ende velges ut og kopieres selektivt.
Sammensetning og lengde av DNA-tråden mellom start- og sluttpunktet kan variere. Informajson om lengden av DNA-fragmentene (visualiseres ved gel-elektroforese), og om kopiering fant sted (positiv/negativ reaksjon) kan brukes til å gjøre enkle genetiske analyser.
Opparbeidet DNA kan (gitt god nok mengde og kvalitet) sendes til nærmere analyse av DNA-sekvensen (sekvensering).

Hvorfor gjøre PCR?

En aktivitet med relativt lav terskel, med begrenset behov for opplæring, gode muligheter for å lykkes, overkommelige kostnader og få risikomomenter.
En klassisk molekylærbiologi-teknikk. I daglig bruk verden over. Uunnværlig for molekylærbiologisk forskning og medisinsk diagnostikk. Nobelpris-vinnende.
Potensiale for praktiske anvendelser med allmenn interesse. F.eks kontroll av artsopprinnelse for matvarer.

Hva trengs for PCR?

Fast utstyr:

PCR-maskin/thermocycler. Automatiserer temperaturegulering gjennom reaksjonsforløpet. Temperatur-regulering kan i teorien gjøres manuelt med vannbad ved ulike temperaturer, men dette blir temmelig langsomt og kjedelig
Mikropipette(r). Fortrinnsvis minst én automatpipette med justerbart volum i området 1-10 μL.
En eller flere flasker til agarose, ca. 250 mL. Glass eller varmebestandig plast, bør passe i mikrobølgeovn.
Mikrobølgeovn til oppvarming av agarose, evt. annen varmekilde + magnetrører
Gel-elektroforesekammer
Strømforsyning
Transilluminator m/filter og/eller filterbriller
Bør ha: Mikrosentrifuge.
Bør ha: Kjøleskap/fryser til oppbevaring av reagenser (PCR mastermix bør oppbevares frosset) og lage is
Kjekt å ha: Vanndestillator
Kjekt å ha: Liten isoporboks eller lignende til å ha is i, for kjøling av prøver under forberedelse.

Forbruksmaterialer:

Eppendorf-rør (plastrør tilpasset mikrosentrifuge, ca. 1.5 mL)
PCR-rør (plastrør tilpasset PCR-maskin, ca 0.5 mL)
Pipette-spisser til automatpipette(r)

Reagenser/kjemikalier:

PCR mastermix
TAE/TBE buffer, konsentrert
DNA-fargestoff (Riktig type med hensyn til transilluminator)
DNA-ladder (Blanding av DNA-fragmenter med kjent lengde. Brukes som referanse for lengde/størrelse av DNA-fragmenter ved elektroforese.)
DNA loading dye (Viskøs fargeblanding til utblanding av PCR-produkt før overføring til agarosegel. Kan "hjemmesnekres"?)
Elektroforese-agarose
DNA-primere (eksperiment-spesifikke)
Vann, fortrinnsvis destillert. Evt. flaskevann med lavt mineralinnhold.

Sikkerhetsutstyr:

Vernebriller
Engangshansker
Varmeisolerende hansker e.l. til håndtering av varm agarose
Fortrinnsvis labfrakk

Sikkerhetsmomenter:

Strøm gjennom elektroforesekammer (ca. 50-100 V)
Varm agaroseløsning
Støtkoking eller glasseksplosjon ved oppvarming av agarose i mikrobølgeovn. Unngås ved å begrense effekt/oppvarmingshastighet, begrense tid under oppvarming og aldri varme opp lukkede flasker/beholdere.
Potensielt skadelige kjemikalier (eks. Ethidum-bromid, "ETBR") og fargestoff som krever bruk av transilluminator med UV-stråling bør unngås. Alternativer med lavere risiko og bedre miljøprofil bør brukes, f.eks "GelGreen" fargestoff (brukes med transilluminator med synlig blått lys, redusert fare for øye/hudskader).

Avfallshåndtering:

Avhenger av reagensvalg! Individuell vurdering må gjøres for hvert stoff. Generelt:

Størknet agarose kastes som restavfall. Flytende agarose må ikke tømmes i avløp, da dette vil størkne ved avkjøling.
Øvrige flytende reagenser kan helles i avløp
Forbruksmateriell av plast med eventuelle reagensrester kastes i restavfall
Utstyr rengjøres med vann etter bruk

Reagenser, mulige leverandører og prisoverslag:

PCR-reagenser:

DongSheng Biotech: http://dongshengbio.com/en/cpjs.asp?classname=PCR%20Products

Taq Mix: http://dongshengbio.com/en/xxcp.asp?id=330/ http://dongshengbio.com/en/UploadFiles/2012516105050871.pdf

Eksempel-bestilling (2014):

Product Name Cat No Description Qty Unit Unit Price Value

Taq Mix (2x) P2011 1 1ml $8.80 $8.80

Water, nuclease-free P9021 1 5x1ml $2.00 $2.00

PCR and DNA Fragment Purification Kit N1091 1 50preps $20.00 $20.00

50bp ladder M1041 1 50ug $16.00 $16.00

6xDNA Loading Dye M9041 1 5x1ml $4.60 $4.60

shipment viaFedEx $55.00

Total $106.40

DNA-fargestoff:

GelGreen:

https://biotium.com/technology/gelred-gelgreen-nucleic-acid-gel-stains/

GelGreen, Carolina.com: http://www.carolina.com/biotechnology-electrophoresis-reagents/gel-green/217305.pr?question= (ca. $64.50 + shipping / 150 uL 10 000 x konsentrasjon. Nok til ca. 30-40 agarose-geleer.)

Suggested protocols for working with GelGreen: http://embitec.com/downloads/Suggested_Protocols-GelGreen.pdf

GelRed-GelGreen Safety report: http://biotium.com/wp-content/uploads/2013/07/GR-GG-Safety.pdf

Elektroforese-buffer:

TAE (Tris/Acetate/EDTA)-buffer, Promega: https://no.promega.com/products/biochemicals-and-labware/biochemical-buffers-and-reagents/tae-buffer_-molecular-biology-grade-_tris_acetate_edta_/ (390 kr/1000 mL 10x konsentrasjon = 39 kr/L ferdig buffer)

TAE elektroforesebuffer 50 x, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/tae-elektroforesebuffer-50x (1 250 kr/ 500 mL 50x konsentrasjon = 50 kr/L ferdig buffer

TBE (Tris/Borate/EDTA)-buffer kan også brukes.

Elektroforese-agarose:

Agarose, 10 g, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/agarose--10-g (kr 319 + frakt. Nok til ca. 10 agarose-gel'er (Gitt 50 mL 2 % agarose). Temmelig dyrt...Har tidligere kjøpt 100g på eBay for USD 40 + frakt.

DNA-primere: Macrogen Inc:

Ca. 0.2 EUR/basepar (bp) x ca. 30 bp x 2 primere = ca. 12 EUR Shipping ca 20 Sum ca. 30-40 EUR. (2013-priser)

Artikler/protokoller og lesestoff

The PCR controls you must use: http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/
Yaest colony PCR. Utvalg av protokoller @ OpenWetware: http://openwetware.org/wiki/Yeast_Colony_PCR
http://www.jove.com/video/3998/polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
Simple And Reliable Procedure For PCR Amplification Of Genomic Dna From Yeast Cells Using Short Sequencing Primers: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
http://openwetware.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
http://no.frederiksen.eu/inspirasjon/biologi/bioteknologi/tips-og-raad
http://www.naturfag.no/utstyrsbeskrivelse/vis.html?tid=709639

DNA Learning Center Biology Animation Library - Polymerase Chain Reaction: https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Possible sub-projects/experiments

In rough order of increasing difficulty/complexity?

Electrophoresis demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for agarose gel electrophoresis. Separate and visualize DNA fragments of known size (DNA ladder).
PCR demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for PCR and agarose gel electrophoresis. Amplify DNA fragment of known expected size from purified DNA or from biological material (yeast?). Visualize and determine size/length of the DNA fragment(s) by agarose gel electrophoresis.
Animal tissue/foodstuff species identification: Demonstrate/test identification of DNA from a suspected/known species in raw or processed food (ex, horsemeat).

DIY PCR-maskiner - Eksisterende design og prosjekter

http://openpcr.org/

https://www.kickstarter.com/projects/563115656/3d-printer-into-pcr-machine-conversion

Arduino PCR thermal cycler for under $85: http://www.instructables.com/id/Arduino-PCR-thermal-cycler-for-under-85/?ALLSTEPS

"Coffee Cup PCR": http://www.instructables.com/id/Coffee-Cup-PCR-Thermocycler-costing-under-350/?ALLSTEPS

http://www.popsci.com/diy/article/2013-04/gene-machine

Tilgjengelige primere

Navn	Sekvens	Beskrivelse	Lengde	Templat
Ec_lld_Rev	GTTTCTTCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAtgcaggtctcctggagtccacgc	REV-primer for E. coli lld promoter + RBS. Se http://2012.igem.org/Team:NTNU_Trondheim/Experiments_and_Results	52	E. coli
Ec_lld_FWD	GTTTCTTCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGcacattcctataggccgagtaaggt	FWD-primer for E. coli lld promoter + RBS.	55	E. coli
Fd2trim	GAGTTTGATCATGGCTCAG			Wide-range bacterial.
Porcine FWD + Porcine REV		[2]

MEATF + MEATR [2]

HorseSSR-FWD + HorseSSR-REV [2]

S-D-Bact-0515-a-A-19 + S-D-Bact-0341-b-S-17 [1]

[1]: See http://openwetware.org/wiki/User:Jarle_Pahr/16S_RNA

[2]: See http://openwetware.org/wiki/User:Jarle_Pahr/Meat

Primers of interest / Shopping list

Yeasts:

"V9D (5'-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3') and LS266 (5'-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3') are used to amplify an 800-1300 bp fragment that encompasses a portion of the 18S and 28S rRNA genes and the entire intervening ITS1, 5.8S and ITS2 rRNA regions." (Todd M Pryce. "Universal Detection and Identification of Fungi by PCR and DNA sequencing" in PCR for Clinical Microbiology, SpringerLink 2010.)

ITS 1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') + ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'). " In the present study, the restriction patterns generated from the region spanning the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and the 5.8S rRNA gene were used to identify a total of 132 yeast species belonging to 25 different genera, including teleomorphic and anamorphic ascomycetous and basidiomycetous yeasts." (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10028278, full text available through ResearchGate).

E. coli:

rrnB p1_74bp_FWD_R caaccggtgttgcgcggtcagaaaatta rrnB p1_74bp_REV_R gtacatgtagtggtggcgcattatagg

Gives a short fragment.

pSB-M1g/pJP-1 plasmids:

pSB-SeqA/GFP-END-LVA-REV. Sequencing of and/or PCR demonstration using plasmid pSB-M1g. PCR from pSB-M1g without adding LVA tag should give fragment of aprox. 800 bp (size of GFP ORF + ~ 1 bp upstream).

pSB-SeqA: tgcaagaagcggatacag

GFP-END-LVA-REV: agaggatcccttaagttaagctactaaagcgtagttttcgtcgtttgctgctttgtatagttcatccatgcc (LVA sequence can be removed from the 5' end).

For PCR from pJP-1, replace pSB-seqA with pJP-1_seq5 (binding site is upstream of AgeI, as such this site is preserved from pSB-mg1, and this primer combination can also be used with pSB-mg1 for a longer PCR fragment)

Lenker

Andre grupper og nettsteder

BioHack Academy: https://biohackacademy.github.io/

https://diybio.org/

https://www.facebook.com/groups/diybio/

GenSpace (New York): http://genspace.org/

La paillasse (PAris) http://lapaillasse.org/

http://biocurious.org/

Biologigaragen (København): http://biologigaragen.org/ & https://www.facebook.com/groups/biologigaragen/

https://biohackspace.org/

http://www.diybiogroningen.org/

http://www.indiebiotech.com/

Liste over grupper på DIYbio.org: https://diybio.org/local/

http://biohackingsafari.com/

BioHacklabs.org Wiki: http://www.biohacklabs.org/Main_Page

Robert Carlson: http://synthesis.cc

London Biohackspace: http://biohackspace.org/

HMS

WHO Laboratory Biosafety Manual, Third Edition: http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf

NTNU - Arbeid med biologiske faktorer: https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Arbeid+med+biologiske+faktorer

https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Biologiske+faktorer

Elektroforese:

https://web.stanford.edu/dept/EHS/prod/researchlab/lab/safety_sheets/08-136.pdf

http://www.ab.ust.hk/hseo/tips/ls/ls008.htm

http://ehs.unl.edu/sop/s-electrophoresis_safety.pdf

http://www.labmanager.com/lab-health-and-safety/2010/05/electrophoresis-safety-tips?fw1pk=2#.V2Wh3_mLRD8

Lover og forskrifter

Lover og forskrifter som er lenket til vil ikke nødvendigvis gjelde for aktiviteter ved Bitraf, men kan likevel brukes som en kilde til HMS-relevant informasjon og veiledning:

Forskrift om utforming og innretning av arbeidsplasser og arbeidslokaler (arbeidsplassforskriften) - Kapittel 8. Arbeid i omgivelser som kan medføre eksponering for biologiske faktorer: http://lovdata.no/forskrift/2011-12-06-1356/§8-1

Forskrift om tiltaksverdier og grenseverdier for fysiske og kjemiske faktorer i arbeidsmiljøet samt smitterisikogrupper for biologiske faktorer (forskrift om tiltaks- og grenseverdier) : https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1358

Forskrift om utførelse av arbeid, bruk av arbeidsutstyr og tilhørende tekniske krav (forskrift om utførelse av arbeid) -Andre del: Krav til arbeid med kjemiske og biologiske risikofaktorer: https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1357/KAPITTEL_2#KAPITTEL_2

http://www.miljodirektoratet.no/no/Tema/Kjemikalier/Kjemikalieregelverk/Klassifisering-og-merking-av-kjemikalier-CLP/Virkeomrade-CLP-avsnitt-I/

http://www.miljodirektoratet.no/no/Tema/Kjemikalier/Kjemikalieregelverk/Kjemikalieregelverket_REACH/Unntak/

http://echa.europa.eu/addressing-chemicals-of-concern/restrictions/substances-restricted-under-reach

Forskrift om begrensning i bruk av helse- og miljøfarlige kjemikalier og andre produkter (produktforskriften): https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2004-06-01-922#KAPITTEL_1

Merk spesielt §5-1:

§ 5-1.Omsetning og import av meget giftige og giftige kjemikalier til privat bruk Til privat bruk er det forbudt å importere kjemikalier merket med faresymbol og farebetegnelse «meget giftig» eller «giftig» i henhold til forskrift om klassifisering, merking mv. av farlige kjemikalier eller som i henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassifisering, merking og emballering av stoffer og stoffblandinger (CLP-forordningen) skal klassifiseres i fareklasse og farekategori Carc. 1A, Carc. 1B, Muta. 1A, Muta. 1B, Repr. 1A, Repr. 1B, Acute Tox. 1, Acute Tox. 2, Acute Tox. 3, STOT RE 1 eller STOT SE 1. Forbudet mot privat import gjelder ikke for motorbensin eller dieselolje til transportformål som innføres på kjøretøyets drivstofftank eller i godkjente reservetanker

Litteratur

Bøker

Biohackers: The Politics of Open Science: http://www.amazon.com/Biohackers-Politics-Science-Alessandro-Delfanti/dp/0745332803/ref=sr_1_3?s=books&ie=UTF8&qid=1463928520&sr=1-3&keywords=biohacker

Open-Source Lab: How to Build Your Own Hardware and Reduce Research Costs: http://www.amazon.com/dp/0124104622/ref=wl_it_dp_o_pC_S_ttl?_encoding=UTF8&colid=2JXTKSS1LI8NT&coliid=I2AIVHRBOC69DXhttp://www.amazon.com/dp/0124104622/ref=wl_it_dp_o_pC_S_ttl?_encoding=UTF8&colid=2JXTKSS1LI8NT&coliid=I2AIVHRBOC69DX

Biopunk: Solving Biotech's Biggest Problems in Kitchens and Garages: http://www.amazon.com/Biopunk-Solving-Biotechs-Problems-Kitchens/dp/1617230073/ref=sr_1_1?s=books&ie=UTF8&qid=1463930140&sr=1-1&keywords=biopunk

The Machinery of Life: http://www.amazon.com/Machinery-Life-David-S-Goodsell/dp/0387849246/ref=pd_sim_14_5?ie=UTF8&dpID=51ZSNcQ3vrL&dpSrc=sims&preST=_AC_UL160_SR106%2C160_&refRID=156THN5QQ1RD2Q4DQ5XB

Illustrated Guide to Home Biology Experiments: http://www.amazon.com/Illustrated-Guide-Home-Biology-Experiments/dp/1449396593?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o08_s00

Techniques in microbiology - a student handbook: http://www.amazon.com/Techniques-Microbiology-Handbook-John-Lammert/dp/0132240114?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o04_s00

Biology Is Technology: The Promise, Peril, and New Business of Engineering Life: http://www.amazon.com/dp/0674060156/ref=rdr_ext_tmb

Exploring Personal Genomics: http://www.amazon.com/Exploring-Personal-Genomics-Joel-Dudley/dp/0199644497?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o06_s00

The Art of Fermentation: An In-Depth Exploration of Essential Concepts and Processes from around the World: http://www.amazon.com/Art-Fermentation-Depth-Exploration-Essential/dp/160358286X?ie=UTF8&psc=1&redirect=true&ref_=oh_aui_detailpage_o06_s00

Artikler

DIY Bio:

European do-it-yourself (DIY) biology: Beyond the hope, hype and horror: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4158858/

DIYBIOLOGISTS AS ‘MAKERS’ OF PERSONAL BIOLOGIES: HOW MAKE MAGAZINE AND MAKER FAIRES CONTRIBUTE IN CONSTITUTING BIOLOGY AS A PERSONAL TECHNOLOGY: http://peerproduction.net/issues/issue-2/peer-reviewed-papers/diybiologists-as-makers/?format=pdf

http://blogs.plos.org/synbio/2016/05/03/synbio-democratizing-biotechnology/

DNA barcoding:

Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)region as a universal DNA barcode marker for