BitLab? BioRaf?

Planlegging

Det har i det siste vært diskusjoner om å starte en egen lab for biologi på Bitraf. Bitraf har allerede medlemmer som jobber med hydroponics/aquaphonics og flere er interessert i ølbrygging. 18 Mai 2016 var det første møtet for folk som er interessert i å starte opp dette. Ønsket er å utvide foreningen med et lokale som egner seg for Gjør-det-selv-biologi og Biologi-hacking som retter seg etter norsk lov og de etiske retningslinjene fremsatt av European DIYbio Congress.

Summary from Bitraf's 1'st MeetUp: https://drive.google.com/file/d/0B5j_-m_-t56rMXNHVVkwVEpUVjg/view

Courses and Equipment: https://docs.google.com/spreadsheets/d/1M2TKaHVBQ3iLuV55A8JCwTCzPXx_aNDFoxyzZBgSM8o/edit#gid=0

Videre jobbing

De av deltakerne som ønsket å jobbe med dette videre delte seg i to grupper som skal jobbe med Mikrobiologi og Utstyr til labben. Mikrobiologi-gruppen har planer for å jobbe med ølbrygging og klassifisering av gjær med Open PCR.

Utstyr vi ønsker oss

OpenPCR
UV-kamera
Fumehood
Filter til Fumehood
Høypresisjons pipetter
Sentrifuge
Vortexer
Fryser
Elektroforese-kammer
Varmeskap med shaker
Mikroskop
Steam cooker for cleaning (Autoklav?)
Lab-glass (flasker, rør m.m.)
Filter-utstyr
Vekst-medier
Qubit Spectrometer (or similar)

I tillegg trenger vi også møblene til et slikt lokale. I Pløens Gate 4 finnes det ledige lokaler som man etter hvert kan etablere selve Lab'en i, men dette ligger et stykke fremover i tid. Finansiering må på plass før man kan ta over mere areal.

PCR prosjekt

Hva er PCR?

Polymerase chain reaction/polymerase kjedereaksjon: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
PCR brukes for å kopiere DNA. En PCR-maskin med reagenser er en "kopi-maskin" for DNA.
PCR kan brukes til å kopiere opp (amplifisere) DNA fra naturlige kilder/biologisk materiale for videre bearbeidelse eller analyse.
DNA-fragmenter med en kjent sekvens (rekkefølge på nukleotider, "bokstavene" i DNA) i hver ende velges ut og kopieres selektivt.
Sammensetning og lengde av DNA-tråden mellom start- og sluttpunktet kan variere. Informajson om lengden av DNA-fragmentene (visualiseres ved gel-elektroforese), og om kopiering fant sted (positiv/negativ reaksjon) kan brukes til å gjøre enkle genetiske analyser.
Opparbeidet DNA kan (gitt god nok mengde og kvalitet) sendes til nærmere analyse av DNA-sekvensen (sekvensering).

Hvorfor gjøre PCR?

En aktivitet med relativt lav terskel, med begrenset behov for opplæring, gode muligheter for å lykkes, overkommelige kostnader og få risikomomenter.
En klassisk molekylærbiologi-teknikk. I daglig bruk verden over. Uunnværlig for molekylærbiologisk forskning og medisinsk diagnostikk. Nobelpris-vinnende.
Potensiale for praktiske anvendelser med allmenn interesse. F.eks kontroll av artsopprinnelse for matvarer.

Hva trengs for PCR?

Fast utstyr:

PCR-maskin/thermocycler. Automatiserer temperaturegulering gjennom reaksjonsforløpet. Temperatur-regulering kan i teorien gjøres manuelt med vannbad ved ulike temperaturer, men dette blir temmelig langsomt og kjedelig
Mikropipette(r). Fortrinnsvis minst én automatpipette med justerbart volum i området 1-10 μL.
En eller flere flasker til agarose, ca. 250 mL. Glass eller varmebestandig plast, bør passe i mikrobølgeovn.
Mikrobølgeovn til oppvarming av agarose, evt. annen varmekilde + magnetrører
Gel-elektroforesekammer
Strømforsyning
Transilluminator m/filter og/eller filterbriller
Bør ha: Mikrosentrifuge.
Bør ha: Kjøleskap/fryser til oppbevaring av reagenser (PCR mastermix bør oppbevares frosset) og lage is
Kjekt å ha: Vanndestillator
Kjekt å ha: Liten isoporboks eller lignende til å ha is i, for kjøling av prøver under forberedelse.

Forbruksmaterialer:

Eppendorf-rør (plastrør tilpasset mikrosentrifuge, ca. 1.5 mL)
PCR-rør (plastrør tilpasset PCR-maskin, ca 0.5 mL)
Pipette-spisser til automatpipette(r)

Reagenser/kjemikalier:

PCR mastermix
TAE/TBE buffer, konsentrert
DNA-fargestoff (Riktig type med hensyn til transilluminator)
DNA-ladder (Blanding av DNA-fragmenter med kjent lengde. Brukes som referanse for lengde/størrelse av DNA-fragmenter ved elektroforese.)
DNA loading dye (Viskøs fargeblanding til utblanding av PCR-produkt før overføring til agarosegel. Kan "hjemmesnekres"?)
Elektroforese-agarose
DNA-primere (eksperiment-spesifikke)
Vann, fortrinnsvis destillert. Evt. flaskevann med lavt mineralinnhold.

Sikkerhetsutstyr:

Vernebriller
Engangshansker
Varmeisolerende hansker e.l. til håndtering av varm agarose
Fortrinnsvis labfrakk

Sikkerhetsmomenter:

Strøm gjennom elektroforesekammer (ca. 50-100 V)
Varm agaroseløsning
Støtkoking eller glasseksplosjon ved oppvarming av agarose i mikrobølgeovn. Unngås ved å begrense effekt/oppvarmingshastighet, begrense tid under oppvarming og aldri varme opp lukkede flasker/beholdere.
Potensielt skadelige kjemikalier (eks. Ethidum-bromid, "ETBR") og fargestoff som krever bruk av transilluminator med UV-stråling bør unngås. Alternativer med lavere risiko og bedre miljøprofil bør brukes, f.eks "GelGreen" fargestoff (brukes med transilluminator med synlig blått lys, redusert fare for øye/hudskader).

Avfallshåndtering:

Avhenger av reagensvalg! Individuell vurdering må gjøres for hvert stoff. Generelt:

Størknet agarose kastes som restavfall. Flytende agarose må ikke tømmes i avløp, da dette vil størkne ved avkjøling.
Øvrige flytende reagenser kan helles i avløp
Forbruksmateriell av plast med eventuelle reagensrester kastes i restavfall
Utstyr rengjøres med vann etter bruk

Reagenser, mulige leverandører og prisoverslag:

PCR-reagenser:

DongSheng Biotech: http://dongshengbio.com/en/cpjs.asp?classname=PCR%20Products

Taq Mix: http://dongshengbio.com/en/xxcp.asp?id=330/ http://dongshengbio.com/en/UploadFiles/2012516105050871.pdf

Eksempel-bestilling (2014):

Product Name Cat No Description Qty Unit Unit Price Value

Taq Mix (2x) P2011 1 1ml $8.80 $8.80

Water, nuclease-free P9021 1 5x1ml $2.00 $2.00

PCR and DNA Fragment Purification Kit N1091 1 50preps $20.00 $20.00

50bp ladder M1041 1 50ug $16.00 $16.00

6xDNA Loading Dye M9041 1 5x1ml $4.60 $4.60

shipment viaFedEx $55.00

Total $106.40

DNA-fargestoff:

GelGreen:

https://biotium.com/technology/gelred-gelgreen-nucleic-acid-gel-stains/

GelGreen, Carolina.com: http://www.carolina.com/biotechnology-electrophoresis-reagents/gel-green/217305.pr?question= (ca. $64.50 + shipping / 150 uL 10 000 x konsentrasjon. Nok til ca. 30-40 agarose-geleer.)

Suggested protocols for working with GelGreen: http://embitec.com/downloads/Suggested_Protocols-GelGreen.pdf

GelRed-GelGreen Safety report: http://biotium.com/wp-content/uploads/2013/07/GR-GG-Safety.pdf

Elektroforese-buffer:

TAE (Tris/Acetate/EDTA)-buffer, Promega: https://no.promega.com/products/biochemicals-and-labware/biochemical-buffers-and-reagents/tae-buffer_-molecular-biology-grade-_tris_acetate_edta_/ (390 kr/1000 mL 10x konsentrasjon = 39 kr/L ferdig buffer)

TAE elektroforesebuffer 50 x, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/tae-elektroforesebuffer-50x (1 250 kr/ 500 mL 50x konsentrasjon = 50 kr/L ferdig buffer

TBE (Tris/Borate/EDTA)-buffer kan også brukes.

Elektroforese-agarose:

Agarose, 10 g, Frederiksen Scientific: http://no.frederiksen.eu/shop/product/agarose--10-g (kr 319 + frakt. Nok til ca. 10 agarose-gel'er (Gitt 50 mL 2 % agarose). Temmelig dyrt...Har tidligere kjøpt 100g på eBay for USD 40 + frakt.

DNA-primere: Macrogen Inc:

Ca. 0.2 EUR/basepar (bp) x ca. 30 bp x 2 primere = ca. 12 EUR Shipping ca 20 Sum ca. 30-40 EUR. (2013-priser)

Artikler/protokoller og lesestoff

The PCR controls you must use: http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/
Yaest colony PCR. Utvalg av protokoller @ OpenWetware: http://openwetware.org/wiki/Yeast_Colony_PCR
http://www.jove.com/video/3998/polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
Simple And Reliable Procedure For PCR Amplification Of Genomic Dna From Yeast Cells Using Short Sequencing Primers: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1080/15216549700202551/pdf
http://openwetware.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
http://no.frederiksen.eu/inspirasjon/biologi/bioteknologi/tips-og-raad
http://www.naturfag.no/utstyrsbeskrivelse/vis.html?tid=709639

DNA Learning Center Biology Animation Library - Polymerase Chain Reaction: https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Possible sub-projects/experiments

In rough order of increasing difficulty/complexity?

Electrophoresis demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for agarose gel electrophoresis. Separate and visualize DNA fragments of known size (DNA ladder).
PCR demonstration/equipment test: Demonstrate/test equipment and reagents for PCR and agarose gel electrophoresis. Amplify DNA fragment of known expected size from purified DNA or from biological material (yeast?). Visualize and determine size/length of the DNA fragment(s) by agarose gel electrophoresis.
Animal tissue/foodstuff species identification: Demonstrate/test identification of DNA from a suspected/known species in raw or processed food (ex, horsemeat).

DIY PCR-maskiner - Eksisterende design og prosjekter

http://openpcr.org/

https://www.kickstarter.com/projects/563115656/3d-printer-into-pcr-machine-conversion

Arduino PCR thermal cycler for under $85: http://www.instructables.com/id/Arduino-PCR-thermal-cycler-for-under-85/?ALLSTEPS

"Coffee Cup PCR": http://www.instructables.com/id/Coffee-Cup-PCR-Thermocycler-costing-under-350/?ALLSTEPS

http://www.popsci.com/diy/article/2013-04/gene-machine

Tilgjengelige primere

Navn	Sekvens	Beskrivelse	Lengde	Templat
Ec_lld_Rev	GTTTCTTCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAtgcaggtctcctggagtccacgc	REV-primer for E. coli lld promoter + RBS. Se http://2012.igem.org/Team:NTNU_Trondheim/Experiments_and_Results	52	E. coli
Ec_lld_FWD	GTTTCTTCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGcacattcctataggccgagtaaggt	FWD-primer for E. coli lld promoter + RBS.	55	E. coli
Fd2trim	GAGTTTGATCATGGCTCAG	Removed 1bp from 5' end of Fd2 primer to better fit with criteria for LightRun sequencing primer, hoping to be able to use the same primer both for PCR amplification and for sequencing of the PCR product. See http://openwetware.org/wiki/User:Jarle_Pahr/16S_RNA		Wide-range bacterial.

Lenker

Andre grupper og nettsteder

BioHack Academy: https://biohackacademy.github.io/

https://diybio.org/

GenSpace: http://genspace.org/

http://biocurious.org/

http://biologigaragen.org/

https://biohackspace.org/

http://www.diybiogroningen.org/

http://www.indiebiotech.com/

Liste over grupper på DIYbio.org: https://diybio.org/local/

BioHacklabs.org Wiki: http://www.biohacklabs.org/Main_Page

HMS

WHO Laboratory Biosafety Manual, Third Edition: http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf

NTNU - Arbeid med biologiske faktorer: https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Arbeid+med+biologiske+faktorer

https://innsida.ntnu.no/wiki/-/wiki/Norsk/Biologiske+faktorer

Lover og forskrifter

Lover og forskrifter som er lenket til vil ikke nødvendigvis gjelde for aktiviteter ved Bitraf, men kan likevel brukes som en kilde til HMS-relevant informasjon og veiledning:

Forskrift om utforming og innretning av arbeidsplasser og arbeidslokaler (arbeidsplassforskriften) - Kapittel 8. Arbeid i omgivelser som kan medføre eksponering for biologiske faktorer: http://lovdata.no/forskrift/2011-12-06-1356/§8-1

Forskrift om tiltaksverdier og grenseverdier for fysiske og kjemiske faktorer i arbeidsmiljøet samt smitterisikogrupper for biologiske faktorer (forskrift om tiltaks- og grenseverdier) : https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1358

Forskrift om utførelse av arbeid, bruk av arbeidsutstyr og tilhørende tekniske krav (forskrift om utførelse av arbeid) -Andre del: Krav til arbeid med kjemiske og biologiske risikofaktorer: https://lovdata.no/dokument/SF/forskrift/2011-12-06-1357/KAPITTEL_2#KAPITTEL_2